染色體步移技術(shù)的改進(jìn)
- 發(fā)布時(shí)間：2018-04-13
- 發(fā)布者： 百度文庫(kù)
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染色體步移（genome walking）是一種克隆方法，可以獲得與已知序列相鄰的未知基因組區(qū)域。在過(guò)去20年研究人員開發(fā)出多種染色體步移的方法，大體可分為三類：反向PCR，連接介導(dǎo)的PCR和隨機(jī)引物PCR。最近，韓國(guó)生物科學(xué)技術(shù)研究所（KRIBB）的一個(gè)研究小組對(duì)傳統(tǒng)的連接介導(dǎo)PCR方法進(jìn)行了改進(jìn)，文章發(fā)表在近期的《Analytical Biochemistry》上。
KRIBB的首席科學(xué)家宋正勛（Jung-Hoon Sohn）認(rèn)為染色體步移是一種很有效的基因克隆方法?！耙坏┠愕玫讲糠值幕蚪M片段，你就能通過(guò)PCR不斷獲得側(cè)翼片段。如果不使用PCR，從DNA文庫(kù)中克隆不但單調(diào)，而且困難。”
然而基于PCR的染色體步移方法面臨著多種問(wèn)題：特異性和效率低，步移距離短，且方法復(fù)雜。宋博士解釋道，盡管PCR一般需要兩個(gè)起始位點(diǎn)，而連接介導(dǎo)的PCR染色體步移只需要單個(gè)起始位點(diǎn)。通過(guò)與缺乏5’端磷酸基團(tuán)的框（cassette）連接，產(chǎn)生了第二個(gè)起始位點(diǎn)。這種方法的問(wèn)題在于往往非特異擴(kuò)增了許多DNA片段。宋博士及其同事開發(fā)的“模板鎖定（template-blocking）”方法降低了這種非特異的擴(kuò)增。
在這種新方法中，研究人員用雙脫氧NTP（ddNTP）填補(bǔ)了限制性酶消化的基因組片段的3’-OH，并與正確設(shè)計(jì)的框連接。這樣，側(cè)翼伴有框的基因組DNA片段就作為靶基因擴(kuò)增的模板，擴(kuò)增引物分別為基因特異的引物和框引物。基因組DNA的末端被ddNTP鎖定，從而大大降低了非特異性擴(kuò)增，并產(chǎn)生了簡(jiǎn)單快速的染色體步移。宋博士稱：“模板鎖定的PCR顯示出高特異性。它既不需要特殊設(shè)計(jì)的引物，也不需要巢式PCR?！?br />
研究人員通過(guò)克隆畢赤酵母的一個(gè)PGK1新啟動(dòng)子和青霉菌的兩個(gè)纖維素酶新基因，來(lái)檢驗(yàn)了這種模板鎖定PCR。這兩種生物的完整基因組序列目前都還沒(méi)有。
宋博士解釋道：“真菌纖維素酶對(duì)于降解纖維素生物質(zhì)產(chǎn)生糖和生物能量非常重要。我們從腐爛的木頭中分離出這種真菌，用于新纖維素酶的克隆。它只是模板鎖定PCR的一個(gè)例子，說(shuō)明在未知基因組信息的情況下，從微生物中克隆基因也很簡(jiǎn)單。”
對(duì)于基因組測(cè)序已經(jīng)完成的少數(shù)物種（如人、小鼠、線蟲、水稻、擬南芥等）來(lái)說(shuō)，可以輕松地從數(shù)據(jù)庫(kù)中找到已知序列的側(cè)翼序列。但是，對(duì)于大多數(shù)生物而言，在不了解它們的基因組序列以前，想要知道一個(gè)已知區(qū)域兩側(cè)的DNA序列，只能采用染色體步移技術(shù)。
盡管全基因組測(cè)序技術(shù)正在迅猛發(fā)展，獲得多個(gè)物種的全基因組序列變得更加容易，但宋認(rèn)為染色體步移的改善對(duì)于實(shí)驗(yàn)室日常工作仍很關(guān)鍵，因?yàn)楹芏喾N感興趣的生物都未完成基因組測(cè)序，或只完成了部分。
KRIBB的首席科學(xué)家宋正勛（Jung-Hoon Sohn）認(rèn)為染色體步移是一種很有效的基因克隆方法?！耙坏┠愕玫讲糠值幕蚪M片段，你就能通過(guò)PCR不斷獲得側(cè)翼片段。如果不使用PCR，從DNA文庫(kù)中克隆不但單調(diào)，而且困難。”
然而基于PCR的染色體步移方法面臨著多種問(wèn)題：特異性和效率低，步移距離短，且方法復(fù)雜。宋博士解釋道，盡管PCR一般需要兩個(gè)起始位點(diǎn)，而連接介導(dǎo)的PCR染色體步移只需要單個(gè)起始位點(diǎn)。通過(guò)與缺乏5’端磷酸基團(tuán)的框（cassette）連接，產(chǎn)生了第二個(gè)起始位點(diǎn)。這種方法的問(wèn)題在于往往非特異擴(kuò)增了許多DNA片段。宋博士及其同事開發(fā)的“模板鎖定（template-blocking）”方法降低了這種非特異的擴(kuò)增。
在這種新方法中，研究人員用雙脫氧NTP（ddNTP）填補(bǔ)了限制性酶消化的基因組片段的3’-OH，并與正確設(shè)計(jì)的框連接。這樣，側(cè)翼伴有框的基因組DNA片段就作為靶基因擴(kuò)增的模板，擴(kuò)增引物分別為基因特異的引物和框引物。基因組DNA的末端被ddNTP鎖定，從而大大降低了非特異性擴(kuò)增，并產(chǎn)生了簡(jiǎn)單快速的染色體步移。宋博士稱：“模板鎖定的PCR顯示出高特異性。它既不需要特殊設(shè)計(jì)的引物，也不需要巢式PCR?！?br />
研究人員通過(guò)克隆畢赤酵母的一個(gè)PGK1新啟動(dòng)子和青霉菌的兩個(gè)纖維素酶新基因，來(lái)檢驗(yàn)了這種模板鎖定PCR。這兩種生物的完整基因組序列目前都還沒(méi)有。
宋博士解釋道：“真菌纖維素酶對(duì)于降解纖維素生物質(zhì)產(chǎn)生糖和生物能量非常重要。我們從腐爛的木頭中分離出這種真菌，用于新纖維素酶的克隆。它只是模板鎖定PCR的一個(gè)例子，說(shuō)明在未知基因組信息的情況下，從微生物中克隆基因也很簡(jiǎn)單。”
對(duì)于基因組測(cè)序已經(jīng)完成的少數(shù)物種（如人、小鼠、線蟲、水稻、擬南芥等）來(lái)說(shuō)，可以輕松地從數(shù)據(jù)庫(kù)中找到已知序列的側(cè)翼序列。但是，對(duì)于大多數(shù)生物而言，在不了解它們的基因組序列以前，想要知道一個(gè)已知區(qū)域兩側(cè)的DNA序列，只能采用染色體步移技術(shù)。
盡管全基因組測(cè)序技術(shù)正在迅猛發(fā)展，獲得多個(gè)物種的全基因組序列變得更加容易，但宋認(rèn)為染色體步移的改善對(duì)于實(shí)驗(yàn)室日常工作仍很關(guān)鍵，因?yàn)楹芏喾N感興趣的生物都未完成基因組測(cè)序，或只完成了部分。
